第三章：实时荧光定量PCR的应用

一、相对定量测定不同样品中基因表达量的相对值

在进行实时荧光定量PCR时，内参基因的选择至关重要，其决定着结果的有效性。以下为选择内参基因时需遵循的几个要点：

• 始终选择表达丰度高且稳定的基因作为内参基因；
• 切忌盲目选择常用的内参基因；
• 常用的内参基因包括GAPDH、Actin和Tublin。

添加内参基因后，结果的计算将更加准确。

二、绝对定量

绝对定量主要是依据标准品测定样品中基因表达量的绝对值（拷贝数）。标准品可包括：

• A/克隆质粒；
• B/PCR产物；
• C/cDNA（需要注意的是，扩增效率测定时无法用于绝对定量）。

拷贝数的计算可以通过以下公式进行：

平均分子量（MW）计算如下：

• dsDNA = (碱基数) × (660道尔顿/碱基)；
• ssDNA = (碱基数) × (330道尔顿/碱基)；
• ssRNA = (碱基数) × (340道尔顿/碱基)。

拷贝数计算公式为：

(6.02 × 10²³ 拷贝数/摩尔) × (浓度 g/ml) / (MW g/mol) = copies/ml。

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