IPS诱导肠类器官的培养过程可分为三个主要阶段：人多能干细胞的培养、内胚层分化及中后肠模式化诱导、以及类器官的培养。本文将专注于类器官培养的步骤。

一、类器官培养准备

在进行类器官培养前，需准备以下试剂和耗材：

• 人正常肠类器官培养试剂盒 (abs9545)
• 基质胶（低因子、无酚红）(abs9495)
• 15 ml离心管 (abs7102)
• 多个15 ml EP管 (abs7119)
• 24孔细胞培养板 (abs7035)
• 金属冰盒

各组分的规格如下：

• 类器官培养基 A：100 ml
• 类器官原代培养缓冲液 B：250 ml
• 原代组织消化液 C：30 ml
• 类器官传代消化液 D：30 ml
• 组织保存液 E：100 ml
• 类器官冻存液 F：20 ml
• 类器官传代培养缓冲液 G：250 ml

二、操作流程

1. 加胶、点板与加液

准备工作包括：

• 将基质胶放在金属冰盒中，置于4℃冰箱中过夜融化。
• 将枪头和离心管预冷至-20℃，至少提前30分钟。
• 融化后的基质胶可在4℃条件下储存，建议在两周内使用。

接种要求使用24孔板，每孔添加25 μl基质胶及500-750 μl类器官培养基。接种密度建议为基质胶总体积与球状体总体积的比例为25:1，亦可使用每25 μl基质胶收集50个球状体的方案。

在金属冰盒或冰上进行操作，确保加胶、混匀与点板的时间控制在30秒内，以保持基质胶的良好流动性。培养板需放于37℃培养箱中胶化40-60分钟后，添加类器官培养基进行培养，适合的培养时间为10-14天。

2. 类器官的传代处理

若类器官数量较多或体积较大，需先收集和洗涤类器官。将培养基吸去，添加冷却的类器官传代培养缓冲液，轻柔吹散基质胶，收集于离心管中。接下来可进行离心，以分离类器官和基质胶。在分层之后，弃去上层液体，保留类器官沉淀。

对于类器官消化，添加类器官传代消化液，时间控制在2-3分钟，以确保细胞团完整。

整个过程还需遵循严格的温度控制，以最大化细胞存活率和再生能力。这些步骤的规范执行是确保类器官成功培养和再生的关键。

三、类器官的冻存

在类器官的指数增长期进行冻存，通常在传代后第3至第4天，选择直径在100-200 μm的类器官进行冻存。步骤包括：收集类器官、洗涤、并根据比例添加冻存液，随后在梯度条件下进行冻存。

四、类器官的复苏与培养

复苏流程包括快速解冻冻存管至37℃，随后将冻存液移入离心管中，添加适量的培养缓冲液二次悬浮，再次离心去除上清液。操作过程中，保持无菌条件至关重要。

在上述各个步骤中，尊龙凯时所提供的相关产品和试剂能够有效提升类器官的培养成功率，为研究人员在疾病建模和药物筛选等领域提供强有力的支持。如对本实验步骤或实验室操作有任何疑问，欢迎随时交流讨论！

在此提醒，严格遵循实验室操作流程和注意事项，可以有效提高实验的成功率，最终实现功能性人类肠道类器官的高效生成功能。

感谢您的关注，期待在未来的实验中一起探讨与实践！