在之前的两期中，我们探讨了细胞转染及慢病毒转染的相关主题。这一期，我们将进一步介绍慢病毒转染的实验操作步骤、注意事项以及常见问题。

一、慢病毒实验步骤

慢病毒实验的流程主要分为以下几个步骤：质粒构建、病毒包装、病毒收集与浓缩、感染靶细胞、筛选与验证。

1. 质粒构建

构建重组质粒，将外源目的基因片段插入质粒载体，最终得到重组质粒，然后在大肠杆菌中转化，提取重组质粒DNA。

2. 病毒包装

将重组质粒DNA与其他包装质粒按说明书规定的比例共同转染293T细胞，48小时和72小时后分别收集含病毒的上清液。

3. 病毒收集与浓缩

将收集到的含病毒上清液以3000rpm离心20分钟，利用0.45μm滤膜去除细胞沉淀。接着在12000rpm下进行初步浓缩，并分装储存于-80°C。必要时可测定病毒滴度。超速离心法和PEG沉淀法都可有效浓缩病毒，但前者设备要求高，而后者虽然操作简单，成本低但效率稍微低一些。

4. 慢病毒转染细胞

第一天：以293T细胞为例，消化收集状态良好的目的细胞，细胞密度调整至1×10⁵个/mL，接种到24孔板中，每孔添加0.5mL，并放置于37℃、5% CO₂培养箱中培养。不同细胞的生长速度可能有所不同，接种量应适当。一般情况下，确保在感染前细胞的汇合度达到30%-50%。

第二天：进行病毒转染。首先，观察293T细胞的生长情况，吸去旧培养基并用预热的新鲜完全培养液（每孔添加0.25mL）替换，继续在37℃、5% CO₂条件下培养4小时。注意操作轻柔，以免细胞受到影响。此时，设定部分孔不添加病毒作为对照组。

第三天：全量换液。观察转染后的细胞状态是否正常，记录观察结果。在未出现异常的情况下，吸去含病毒的培养液，添加新鲜完全培养液继续培养。

第四至第六天：观察转染效果。如转染了带荧光的慢病毒，可在转染后48小时通过荧光显微镜检测其荧光强度，以初步评估转染效果。同时，可以开始使用适宜浓度的puromycin或其他筛选药物，以筛选出成功转染的细胞。对于生长缓慢的细胞，可适当延长观察时间至96小时。

二、慢病毒实验注意事项

（1）病毒保存：短期内可在4℃保存（不超过一周），长期保存需分装并存放于-80℃，不超过6个月，使用前需在冰上融化，避免反复冻融以影响病毒活性。

（2）细胞状态：选用生长处于对数期的细胞转染，确保细胞活性良好，这对提高转染效率至关重要。

（3）细胞接种密度：应根据细胞的增殖速度及培养器皿的大小调整，一般转染前细胞的密度要维持在30%-50%。对于生长缓慢的细胞系或原代细胞，接种密度可高达90%。

（4）MOI值的设置：通常MOI值越高，细胞越难以转染。因此，转染前需计数细胞，并准确计算细胞接种量。

（5）实验准备：实验前需查阅相关文献，了解靶细胞的培养条件、生长速度、MOI值等，以优化转染条件。

（6）观察细胞状态：在转染前后需定期观察细胞状态，若转染后细胞状态不佳，可先不加入筛选药物，待细胞恢复后再进行。

（7）观察转染效率：一般在转染后48至72小时之间观察，增殖缓慢的细胞可延长至96小时甚至更久。

三、实验常见问题

Q1: 如何提高慢病毒对细胞的感染效率？感染效率受多种因素影响，如细胞状态、接种数量、感染难易度等。确保细胞状态良好、密度适中可提高感染效率。对于悬浮细胞，采用离心感染法，通过低速离心去掉大部分上清液，然后加入适量病毒液，并在室温下静置一定时间。

Q2: 转染后细胞死亡的原因及应对措施？细胞转染过程中存在多种潜在影响因素。确保细胞的良好状态和适当的感染条件是关键。选择适当的感染方法，并在操作时小心处理可以降低细胞损伤。

Q3: 瞬时转染与稳定转染的区别是什么？无论是瞬时还是稳定转染，都可能导致DNA在细胞核内随机整合。不同之处在于稳定转染允许后期通过抗性基因选择出成功转染的细胞，而瞬时转染则没有筛选，阳性细胞在传代中数量会减少。

Q4: 慢病毒转染时细胞接种量应如何调整？接种量应依据细胞增殖速度及培养器皿大小进行调整，通常感染后4天左右细胞应适度汇合，大部分细胞系需维持密度在20%~30%之间，特定条件下可适度提高。

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